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[其他方面]聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的机理

发布时间：2009/6/10 阅读次数：1730 字体大小: 【小】【中】【大】

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聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的机理

聚丙烯酰胺胶电泳体系有二种：连续体系与不连续体系。前者指整个电泳体系中所用的缓冲液成分、PH、凝胶网都相同；后者指在电泳体系中采用两种以上的缓冲液、PH值和孔径。按电泳装置不同又可分为垂直管状(圆盘)电泳和垂直平板电泳。这两种电泳操作方式基本相同，不同的只是用于凝胶的支架或为玻璃管，或为玻璃板。这里以最常用的不连续体系的管型盘状电泳为例，说明凝胶分离蛋白质的机理。

(一)盘状电泳凝胶组成

胶组成缓冲液

T(%) C(%) 阳离子阴离子 PH电极缓冲液 Tris⁺ Cly^- 8.3

样品胶　3.1 20 Tris⁺Cl^- 6.7 浓缩胶　 3.1 20 　Tris⁺Cl^- 6.7

分离胶 7.2 　2.6 Tris⁺ Cl^- 8.9

电极缓冲液

图5 盘状电泳3种胶的组成(Davis标准状态)

图5为聚丙烯酰胺电泳组成示意图。电泳槽与凝胶中缓冲液的成分、PH值和离子强度均不相同。使得盘状电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应；②凝胶的分子筛效应；③一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。下面就盘状电泳过程中三种物理效应的原理加以说明。

(二)样品分离的机理

1.样品的浓缩效应：

由于电泳基质的四个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。

(1)凝胶层的不连续性：三层不同的凝胶其作用如下：

a.样品胶(sample gel)：为大孔胶，用光聚合法制备，样品预先加在其中，起防止对流的作用，避免样品跑到上面的缓冲液中，(目前电泳一般不制作此胶)。

b.浓缩胶(stacking gel)：为大孔胶，用光聚合法制备，有防止对流作用。样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。

c.分离胶(seperatoing gel)：为小孔胶，一般采用化学聚合法制备。样品在其中进行电泳和分子筛分离，也有防对流作用，蛋白质分子在大孔径凝胶中受到的阻力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到阻力大，速度就减慢了，由于凝胶的不连续性，在大孔与小孔凝胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。

(2)缓冲离子成分的不连续性

在电场中如有二种电荷符号相同的离子向同一方向泳动，其迁移率不同，两种离子若能形成界面，则走在前面的离子称为快离子，又称前导离子(leading ion)，走在后面的离子称慢离子，又称尾随离子(trailing ion)。为了使样品达到浓缩的目的，需在电泳缓冲系统中加入有效迁移率大小不同的两种离子，并使这两种离子在缓冲系统中组成不连续的两相，即在三层凝胶中加入快离子，在电极缓冲液中加入慢离子。

为了保持溶液的电中性及一定的PH值，需加入一种与快、慢离子符号相反的离子，称为缓冲配对离子(buffer counter ion)，使缓冲配对离子分布于全部电泳缓冲系统中(即三层凝胶及电极缓冲液中)。例如，分离蛋白质样品时，通常用氯根(Cl^-)为快离子，甘氨酸根负离子(NH₂CH₂COO^-)为慢离子，三羟甲基氨基甲烷(Tris⁺)作为缓冲配对离子。

图6 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理示意图

(a)电泳开始时；(b)样品进入浓缩胶被浓缩成一薄层；(c)样品进入分离胶被分离。

电泳开始前(图6A) 慢离子位于两个电极槽中，快离子分布在三层凝胶中，样品在样品胶中，缓冲配对离子位于全部系统中。

电泳进行中(图 6B) 快离子与慢离子的界面向下移动。

由于选择适当的PH值缓冲液，使蛋白质样品的有效迁移率介于快、慢离子的界面处，而浓缩成为极窄的区带。它们的有效迁移率，按下列次序排列，m_clα_cl＞ m _pα_p＞ m _Gα_G。样品若是有颜色的，可以看到样品在界面处堆积浓缩成极窄的区带。

样品分离(图6C) 当样品达到浓凝胶与分离界面处，离子界面继续前进，蛋白质被留在后面，然后分成多个区带。

(3)电位梯度的不连续性

电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关，因为电泳速度等于电位梯度与迁移率的乘积，迁移率低的离子，在高电位梯度中可以与具有高迁移率而处于低电位梯度的离子具有相似的速度。

v_i＝m_iα_iE 要v一样 mα低的，E要高

在不连续系统中，电位梯度的差异是自动形成的。

电泳开始后，由于快离子的迁移率最大，就会很快超过蛋白质，因此在快离子的后边形成一个离子浓度低的区域即低电导区。电导与电位梯度是成反比的。

V＝IR＝I ∵L＝1/R ∴E＝V/l＝I/Ll

V.电压；I.电流；R.电阻；L.电导；E.电位梯度V/l

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图7 不连续系统浓缩效应示意图

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快离子

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慢离子

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蛋白质

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高电位梯度

低电位梯度

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电极缓冲液样品胶

浓缩胶

分离胶

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因在串联电路中，电流处处相等，因此，I＝ELl，在低电导区就有较高的电位梯度。这种高电位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。当快离子、慢离子和蛋白质有效迁移率和电位梯度的乘积彼此相等时，(mαE)_快＝(mαE)_p＝(mαE)_慢＝v，则三种离子移动速度相同，在快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立之后，则快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳板移动的界面。也就是说在高电位梯度区和低电位梯度区之间的地方形成一个迅速移动的界面(图7)，由于蛋白质样品的有效迁移率恰好介于快慢离子之间，因此也就聚焦在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层。

(4)PH的不连续性

在浓缩胶与分离胶之间有PH的不连续性，这是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，要求在样品胶和浓缩胶中，慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品夹在快、慢离子界面之间，使样品浓缩。而在分离胶中慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。

(1)浓缩胶应有的PH值

在PH8.0以上时，血清中的蛋白质迁移率在-0.6～-7.5迁移率单位之间，要求甘氨酸的有效迁移率小于-0.6单位。设为-0.5单位，即m _Gα_G＝-0.5，已知 m _G＝-15

α_G ＝ -0.5/-15 ＝ 1/30

又 PH＝PK_a+1ga/(1-a)

已知，甘氨酸PK_a＝9.8 与α值一起代入上式，计算出PH为8.3，

(2)分离胶应有的PH值

在分离胶中要求甘氨酸有效迁移率(m _Gα_G)超过所有蛋白质的有效迁移率，这样甘氨酸的泳动速度即超过所有的蛋白质，使分离胶保持均一的PH及电位梯度，以使蛋白质样品在其中进行普通的电泳分离和分子筛分离。

血清中的前清蛋白在7.5%凝胶中迁移率小于-5.0单位，则m _Gα_G至少应为-5.0，即α＝1/3 (∵m_G＝-15 α＝-5/-15 ＝ 1/3 )，按 PH＝PK_a+1g a/(1-a) 计算, PH应为9.5。

实际上Davis所用的配方中，分离胶的PH值为8.9，但在电泳分离时，根据实际测定证明与理论计算相符，实际上比原制备时的PH约高出半个PH单位，所以与要求的数值是符合的。

2.分子筛效应

分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，即所谓分子筛效应，即使净电荷相似，也就是说自由迁移率相等的蛋白质分子，也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。

此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，小分子走在前面，大分子走在后面与凝胶层析的分子筛效应相反。

3.电荷效应

蛋白质混合物在胶界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。承载有效电荷多的，泳动得快，反之则慢，因此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的圆盘状。在进入分离胶时，此种电荷效应仍起主要作用。

综上所述，样品的浓缩效应是在浓缩胶中进行的，电荷效应与分子筛效应主要是在分离胶中进行的。在蛋白质样品进入分离胶时，由于在浓缩胶中的慢离子跑到蛋白质前面去，高电势梯度消失，使蛋白质进入到均一电势梯度和PH的分离胶中。此时，又由于分离胶的孔径小，各蛋白质因分子大小和形状不一样而被这孔径阻滞的程度也不相同，使一些即使是净电荷相同的蛋白质分子也因分子筛效应不同而得到分离。

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