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[其他方面]聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦技术

发布时间：2009/6/10 阅读次数：1107 字体大小: 【小】【中】【大】

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聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦技术

等电聚焦(isoelectric focusing)，缩写为IEF或EF，也称等电分离、等电点划分，等电点分析、聚焦电泳等，是六十年代后期才发展起来的新技术，它不仅用来分离、鉴定和测定蛋白质等电点，分离复合蛋白，同时还可以结合SDS电泳，密度梯度和一般凝胶电泳进行双向电泳来分析蛋白质的亚基，分子大小和各种蛋白质成分的图谱，因此，它已成为电泳中不可缺少的技术。

(一)原理

等电点聚焦就是在电泳槽中放入两性电解质载体，通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的PH梯度，当蛋白质放进此体系时，不同蛋白质即移动到或聚焦于与其相当的等电点PH位置上。其原理可用图13表示。

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图13 等电聚焦原理

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电泳槽中放入两性电解质载体和蛋白质样品1、2、3其等电点分别为PI₁、PI₂、PI₃。两性电解质在阳极的两性介质中会得到质子而带正电，在阴极碱性介质中则失去质子而带负电，这样就会受电场力的作用各自向相反方向移动。如果有很多的两性电解质，它们就会按照等电点由低到高的顺序在电泳槽中依次排列。于是形成一个由阴极到阳极连续增加的PH梯度。蛋白质也是一种两性分子，在电场中按其表面所带电荷进行移动。A开始带正电，它就向负极高PH区域移动，分子的负电荷逐步增加，即通过羧基和氨基的去极化，最后达到净电荷为零。反之，C种蛋白质分子表面电荷是带负电荷，它就向PH低的区域移动，当分子净电荷达到零时也停止运动。这样根据蛋白质所带电荷不同就可以进行分离。净电荷为零的区域就是该蛋白质的等电点(PI)。因此，根据PH梯度和泳动的距离就可以测出蛋白质的等电点。

目前常用的载体两性电解质商品有ampholine(LKB公司)、Pharmlyte(Pharmacia)、Serralyte(Serva)以及国产的Ampholine(上海生化所东风厂生产)。Ampholine(图14)是具有多等电点的多氨基多羧基酸类化合物，其主要理化性质为：①缓冲性能强 Ampholine溶液在一定PH范围内有充分的缓冲能力，当蛋白质进入与其等电点相应的PH区域时，PH值并无变化；②导电性能好 Ampholine溶液有均衡的电场强度，但是在PH等于中性的区域导电性能较差。因此在应用时，不管选择什么PH范围，一般都要加入其总量1/10的PH6～8的Ampholine溶液，以保持电场强度的均匀性；③分子量小 Ampholine一般分子量都在300～1000之间。一便用分子筛或透析等方法将它与被分离的高分子物质分开；④紫外吸收值低 Ampholine对于在280nm处测定蛋白质吸收值的干扰小，但是如果蛋白质浓度低，Ampholine用量又高，则往往干扰较明显，严重时应进行矫正；⑤一般与样品不起化学反应。

图14 瑞典LKB公司Ampholine的结构式PH范围

等电聚焦的优点是：①有很高的分辨率，可将等电点相差0.01～0.02PH单位的蛋白质分开；②一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能抵消扩散作用，使区带越走越窄；③由于这种电聚焦作用，不管样品加在什么部位，都可聚焦到其等电点处，很稀的样品也可进行分离；④可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01PH单位。等电聚焦电泳也有缺点，一是电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀，二是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用于在等电点时发生沉淀或变性的蛋白质。

电聚焦技术要求有稳定的PH梯度，要求有防止对流和防止已分离区带再混合的措施，其办法有三：密度梯度等电聚焦，聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦和区带对流等电聚焦，本文仅介绍以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的等电聚焦的技术。聚丙烯胺凝胶等电聚焦电泳其原理已与普通聚丙烯酰胺凝胶电泳不同，它不利用凝胶的分子筛作用。

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