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[其他方面]影响电泳的外界因素

发布时间：2009/6/10 阅读次数：1685 字体大小: 【小】【中】【大】

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影响电泳的外界因素
电泳速度除受颗粒本身的性质如带电性，直径大小等影响外，还受其他外界因素的影响。
1.电场
(1)电场强度(电势梯度)
电场强度是指单位长度上的电压降(v/cm)。由(2)式见，电场强度E对泳动速度起着十分重要的作用，电场强度越大，电泳速度越快，单位时间内颗粒迁移的距离就越大，电泳时间就可缩短。根据电场强度的大小可将电泳分为二类：常压电泳(100～500v)与高压电泳(500～1000v),前者电场强度一般为2～10v/cm，后者为20～200v/cm，常压电泳分离时间长，需数小时到数天，多用于分离大分子物质，高压电泳分离时间短，有时仅需数分钟，多用于分离小分子物质。

在实际工作中有时需要进行快速电泳，如果没有高压电泳设备，人们往往利用上述原理，把常压电泳槽小型化，缩短支持介质的两端距离。例如将原来两端相距20cm 改为5cm，此时外加电压虽仍是200v，但电场强度则从10v/cm变为40v/cm，这就加快了电泳速度。有时为了使样品迁移率放慢，也可调小电压，降低电势梯度。

(2)电极及电极反应

电泳的电极材料大都选用铂金丝，铂金丝的安放位置影响电场强度。如两极间铂金丝位置放得不好，电场强度不均匀，常会使电泳谱带弯曲或同一样品的迁移速率不一样。

通电过程中电极二端会发生电解反应：

正极(氧化极)H₂O→2H⁺+1/2O₂↑+2e^-　

负极(还原极)2H₂O+2e^-→2OH^-+H₂↑　

因此在电泳过程中，正负极均可看到气体产生(负极有密集的氢气泡，正极有较大的氧气泡)，电泳过后，两个电泳槽的PH可相差很大(2～4个 PH)。另外电泳过程中会产生热量，尤其是高压电泳，因此高压电泳槽要附有冷却设备，常压电泳可放在冰箱中降温。

2.缓冲液

缓冲液的成分及浓度决定并稳定着支持介质的PH和溶液的离子强度，并影响着带电颗粒的迁移率。

(1)成分 通常电泳用的缓冲液有：巴比妥(钠)；硼酸(钠)；磷酸盐；Tris等。要根据电泳类型和对象选用缓冲液成分，例如用纸电泳分离血清蛋白可选用巴比妥-巴比妥钠缓冲液，而聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶常可用Tris- 甘氨酸缓冲液……。缓冲液成分总的要求：不使样品变性，不改变支持物的理化性质，不影响电泳后染色，有利于电泳的进行及样品的分离。
(2)浓度 主要影响溶液的离子强度(μ)。离子强度是离子浓度(C_i)和离子价数(z _i)的函数μ＝f(c_i、z_i)稀溶液的离子强度可用下式计算

μ＝1/2Σ₁^SC_iZ_i²

式中s表示共有s种离子；C_i为离子的摩尔浓度；z_i为离子价数。例如0.01mol/L Na₂SO₄加0.02mol/L NaCl溶液的离子强度应为：

μ＝1/2(0.01×1²+0.01×2²+0.02×1²+0.02×1²) ＝0.045

离子强度越高，颗粒的迁移速度就越慢。在电解质溶液中，带电荷的颗粒能把一些带有相反电荷的离子吸引在其周围，形成一个离子扩散层。一方面影响颗粒所带的电荷，降低其在电场中的电场力F，从而影响迁移速度(式2)；另一方面，当加以电场时，颗粒向与其电荷相反的电极移动，即带正电荷颗粒移向负极，带负电荷颗粒移向正极，离子扩散层由于携带过剩的与颗粒符号相反的电荷，则向相反方向移动，结果因颗粒与离子扩散层之间的静电引力，使颗粒迁移速度减慢。上述(8)式是由理想的绝缘体系推导的，如果考虑离子强度的影响：

μ＝(Q/6πrη)/(1+kμ^1/2r)

k为常数，25℃,k＝0.33×10³,μ为离子强度。

缓冲溶液浓度低时，离子强度减少，会影响溶液的导电性，样品分子扩散加重，分辨率下降。因此缓冲液的离子强度应有个适宜的范围，一般控制在0.02～0.2之间。
(3)PH

溶液的PH值决定了带电颗粒解离的程度，决定了物质所带电荷的性质和数量，也决定了样品的迁移方向。以蛋白质为例，当溶液的PH低于蛋白质等电点时，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液PH大于等电点时，蛋白质分子带负电荷，成为阴离子，PH值离等电点越远，颗粒所带净电荷越多，迁移速度越快，反之越慢。图3表示了不同PH条件下，蛋白质分子带电荷情况及其在电场中运动状态。

-H⁺

</DIV>

-H⁺

</DIV>

PH＜PI

PH＝PI

PH＞PI

蛋白分子的电荷

+H⁺

</DIV>

⁺H₃N-R-COOH

+H⁺

</DIV>

⁺H₃N -R-COO^-

H₂N-R-COO^-

离子形式

阳离子

两性离子

阴离子

在电场中的迁移方向

向阴极

不迁移

向阳极

图3 蛋白质分子在不同PH条件下所带电荷及其在电场中迁移方向的示意图

因此，当分离某一蛋白质混合物时，应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差异的PH缓冲液。电泳时，正负电极接线也要随PH变化而变化，例如在碱性条件下，蛋白质带负电荷，正极应接在远离加样品的一方，以使蛋白质在支持物上定向迁移。

3．支持物

多数电泳都有支持物，如纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，然而支持物的结构与性质对带电颗粒的迁移率有很大影响，主要表现为对样品的吸附，产生电渗与分子筛效应。

支持物对样品的吸附，使带电颗粒泳动过程中，摩擦力增加，一方面降低了迁移速度，另一方面导致样品拖尾，故使分辨率下降。

在电场中液体对于团体支持物的相对移动称为电渗。例如在纸电泳中，由于组成纸的纤维素带负电荷，因感应相吸而使与纸相接触的水层带正电荷(H₃O⁺)，使溶液在电场作用下向负极移动，并带动物质向负极移动。如果样品原来带正电荷应向负极移动，结果由于电渗使样品移动得更快，反之就会变慢，甚至倒退。用PH 8.6的巴比妥缓冲液进行血清纸电泳，在这PH下蛋白质带负电荷应向正极移动，可是r-球蛋白却移向负极，这就是电渗造成的，因为这时溶液向负极流动，对蛋白质颗粒泳动起阻碍作用，又加上r-球蛋白分子颗粒较大，移动慢，电渗作用大于颗粒的泳动力，结果使颗粒后退。纸和淀粉等支持物电渗作用明显，醋酸纤维和聚丙烯酰胺凝胶电渗较小。

分子筛是凝胶电泳的一个特性，用来作电泳的凝胶通常具有网状结构且具有弹性的半固体物质，具有分子筛作用，使小颗粒易透过，而大颗粒不易通过，凝胶的分子筛效应对分离样品是有利的。

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