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[其他方面]电泳的原理

发布时间：2009/6/10 阅读次数：861 字体大小: 【小】【中】【大】

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电泳的原理

电泳(electrophoresis)是指带电颗粒在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。在生物化学及分子生物学中，主要是根据生物大分子所带电荷的数量及其在分子表面排布的不同来对它们进行分离和鉴定。电泳现象早在1809年就被发现，但将这种现象用于生物化学领域却萌芽于十九世纪初，1907年，有人曾研究过白喉毒素在琼脂中的电泳；1937年，瑞典的Tiselius建立了“移界电泳法”(moving boundary EP),成功地将血清蛋白质分成5个主要成分，即清蛋白、α₁-、α₂-、β-和γ-球蛋白。其后的几十年，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生。以所采用的固体支持物区分，有纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳

表1 电泳技术的种类

类别	名称	型式
不用支持体的电泳技术	1． Tiselleas式微量电泳 2．显微电泳 3．等电点聚焦电泳 4．等速电泳 5．密度梯度电泳	属自由电泳
用支持体的电泳技术	1．纸上电泳 2．醋酸纤维薄膜电泳 3．薄层电泳 4．非凝胶性支持体区带电泳支持体有：淀粉、纤维素粉、玻璃粉硅胶、合成树脂粉末 5．凝胶支持体区带电泳 (1)淀粉胶 (2)聚丙烯酰胺 ①圆盘电泳法 ②平板法 ③SDS-凝胶电泳法 (3)琼脂糖凝胶电泳 (4)琼脂凝胶电泳	包括常压、高压电泳 (水平式或垂直式) 水平式或垂直式 (平板法、柱形法及线丝法) 垂直式(柱形法) 垂直式或水平式垂直式(测分子量) 平板法或柱形法 (如免疫电泳)
其他用法	1．双向电泳 2．电泳—层析相结合 3．交叉电泳纸 4．连续低电泳

等；以电泳形式区分，有在液体介质中进行的，有将支持物做成薄膜或薄层的，有板形或柱形的等(表1)。电泳由于与光学装置、自动记录仪及自动部分收集器结合，又组成了等电点聚焦仪、等速电泳仪等等，80年代末发展起来的毛细管电泳(capillary electrophoresis)是在毛细管中装入缓冲液，在其一端注入样品，在毛细管两端加直流高电压实现对样品的分离…… 这些都极大地发展和扩大了电泳技术的应用范围。

电泳按其分离的原理大致可分为四类：区带电泳(zone EP，ZEP)、移界电泳(moving boundary EP，MBEP)、等速电泳(isotachophoresis，ITP)和等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)。现将各种电泳分离原理简单介绍如下：

1．区带电泳 如图1(a)所示，不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，用光密度计扫描可得到一个个互相分离的峰。电泳的区带随时间延长和距离加大而扩散严重，影响分辨率。加不同的介质可减少扩散，特别是在凝胶中进行，它兼具分子筛的作用，分辨率大大提高，是应用最广泛的电泳技术。

2．移界电泳 如图1(b)所示，它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得到一个个台阶状的图形，最前面的成分有部分是纯的，其他则互相重叠。各界面可用光学方法显示，这就是Tiselius最早建立的电泳方法。

3．等速电泳 如图1(c)所示，在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按距离对浓度作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。

4. 等电聚焦 如图1(d)所示，由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成PH梯度，被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率很高。

a b c d

图1 不同电泳法的分离原理示意图

a．区带电泳；b．移动界面电泳；c．等速电泳；d．等电聚焦

电泳技术由于具有快速、简便及高分辨率等优点，其应用十分广泛。从分离与分析无机离子到复杂的生物高分子化合物，以及在放射化学和免疫化学中都占有重要的地位；在生化实验室和生化工业方面应用更为普通；医药部门还用作临床诊断。在各类电泳技术中，尤以凝胶电泳在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子等方面分辨力为最高，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。本文主要介绍聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理与技术。

(一)迁移率(泳动度)

1．电泳速度

设溶液中有一带有正电荷Q的颗粒，在强度为E的电场影响下移动，带电颗粒所受的力为F＝QE。同时此颗粒的移动受到方向相反的摩擦力F¹＝f v的阻碍，f代表摩擦系数，v代表速度。当这两种力相等时，颗粒以速度v向前迁移(图2)。即

QE＝f v………………………………………………………………………(1)

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v＝QE/f………………………………………………………………………(2)

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F′=fv

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F =QE

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图2 带电颗粒在电场中迁移的受力情况

摩擦系数f和扩散系数D的关系为

f＝KT/D………………………………………………………………………(3)

其中K为布氏常数，T为绝对温度，因此可以从颗粒的扩散系数求出。

根据Stoke定律，一球形分子在溶液中泳动所受的阻力

F¹＝6πrηV…………………………………………………………………(4)

r为颗粒半径，η为介质粘度，v为泳动速度。

(4)式同F¹＝ f V式比较可得：

f＝6πrη……………………………………………………………………(5)

(5)式代入(2)式得：

V＝QE/6πrη…………………………………………………………………(6)

由(6)式可知，带电颗粒在电场中的电泳速度v与其所带电荷Q，电场强度E成正比，与颗粒半径r大小，液体粘度系数η成反比。即在同一电场同一介质中的颗粒，如带电荷数不同或颗粒大小不同, 则各自电泳速度不同，因而电泳能使各颗粒分开。

2．迁移率

颗粒在电场中移动的快慢一般不用电泳速度来表示。因为同一颗粒在不同电场中其电泳速度是不同的，由(2)式或(4)式可见速度是电场强度的函数，V ＝ f(E),用v不能反映颗粒本身的特性。因此，颗粒移动快慢通常用迁移率μ或m来表示。泳动度为带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度。即:

μ＝v/E＝(d/t)/(V/l) ＝dl/Vt(cm²·v^-1·s^-1) ………………………………(7)

d为颗粒泳动距离(cm),l为支持物的有效长度(cm),V为加在支持物两端的实际电压(v), t为通电时间(s)
(6)式代入(7):

μ＝Q/6πrη……………………………………………………………………(8)

由(8)式可见，迁移率与带电颗的带电荷数，半径、介质粘度有关，而与电场强度无关。所以说，在确定条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的物化特性常数。
3．有效迁移率

由迁移率的定义式μ＝v/E 可得

v ＝μ E…………………………………………………………………………(9)

即电泳速度与迁移率和电场强度成正比。
由于电解质在溶液中不同程度的电离对离子迁移速度影响较大，因此，在实际电泳过程中，离子在电场力作用下电流速度是由下式决定的。

v ＝αμE…………………………………………………………………………(10)

式中α是电离度，μ是离子迁移率，αμ称为有效迁移率。显然，带电颗粒的有效迁移率大，其电泳速度也就大。
离子有效迁移率在讨论聚丙烯酰胺凝胶电泳时是一个很有用的物理量。因为在粗孔胶中为了保证蛋白质p夹在先行离子Cl^-和随后离子甘氨酸根G^-之间使蛋白质样品浓缩、压成薄片就必须对粗孔胶设计一个缓冲体系，以使得它维持的PH值所造成的离子解离度，刚好满足如下关系，即
α_C1- m _C1- ＞α_P- m _P- ＞α_G- m _G-

这就是电场强度相同时离子在粗孔胶中实际迁移的顺序。式中的m就是离子迁移率u，之所以变更符号，其原因是它所用的单位常以10^-5cm²·V^-1·s^-1为一个m 单位。
当分离成分电泳到细孔胶后，由于要使蛋白质在这一分离胶中分开成区带，而不使甘氨酸根影响蛋白质的分离，因此需要设计另一个PH缓冲体系，使之满足
α_C1- m _C1-＞α_Gm_G＞ α_P- m _P-
这时随后离子一跃而起超过各种蛋白质。

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